灌流固定

実験

灌流固定

試薬

4％PFA 400ml

• PFA　17.58g
• 10N NaOH 15.2μl
• milliQ 160ml
• 1M PB40ml
• 試験瓶に直接作る。PFA,NaOH,milliQを入れ55℃で温める。溶けたら、冷まして１MPBを加え、milliQで400ｍｌにする

150mM NaCl 50ml

• 5M NaCl 1.5ml
• milliQで50mlにする

PBS 500ml

• 10×PBS 50ml
• milliQ 450ml

5M NaCl 100ml

• NaCl 29.2g
• milliQ 80ml以上
• 80mlでは溶けないので（milli）Qを加えながら溶かす。溶けたらQで100mlにメスアップ。オートクレーブ

2.5% アバチン 10ml

• 100％アバチン 250μl
• PBSで10mlに。遮光して4℃で保存

1M PB 500ml

• Na2HPO4・12H2O 138.6g
• NaH2PO4・2H2O 17.6g
• レンジで温めたQに溶かしたあと、500mlにQでメスアップ。オートクレーブ

手順

1. アバチン（0.5ml）をマウスに腹腔内注射し麻酔する
2. 体重測定。尾を切断（30℃で保存）
3. マウスを手術台に固定。開腹開胸し、心臓を露出させる
4. ぺリスたポンプで灌流固定。遅い速度で150mM NaClを流しながら先を少し曲げた注射針を左心室に入れ、右心耳を切る
5. 150mM NaClを250ml/minで￥の速度で2分間灌流。肝臓から血が抜けるのを確認
6. 灌流液をPFA（氷冷、40ml）に変え、250ml/minで液がなくなるまで灌流。尾が踊るのを確認
7. マウスの脳を取り出して、PBS（氷冷）の中に入れておく