ラベル プロトコル の投稿を表示しています。 すべての投稿を表示
ラベル プロトコル の投稿を表示しています。 すべての投稿を表示

2015年2月25日水曜日

ImageJ(TurboReg)をMatlabで操作

久々々の投稿。
ImageJのプラグインTurboReg(連続画像ブレ補正ソフト、何故かとてもよく動く)的なものを使う必要があって、何とかMatlabでできないかと(matlabのimage processing toolbox付属のは何故か上手く動かなかった)色々調べてたら便利なものが出てきて、かつインストールが面倒だったのでメモ。

 見つけたのはこのサイト
で、必要なものが色々な場所にバラけていたので各個確保する必要がある。

 ----------------------------------
参照するのは下記の３つ。基本的にmファイルはmatlabのパスが通っている場所に、jarファイルはmatlab本体ディレクトリ下java/jar内に、classファイルはmatlab本体ディレクトリ下javaディレクトリに入れる。
ソース 1: mouse-electrophysiology-project(Google code) ソース 2: arterioj/ImageJ/plugins/TurboReg (GitHub) ソース 3: MIJ (Biomedical Imaging Group: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, EPFL) matlab script: ソース 1: mouse-electrophysiology-projectから - array2ijStackAK.m - ij2arrayAK.m 少し場所が変わって - MotionCorrection_TurboReg.m jar file: ソース 3: MIJ　から - mij.jar - ij.jar class file: ソース 1: mouse-electrophysiology-projectから - IJAlin_AK.class - TurboReg_AK.class ソース 2: arterioj/ImageJ/plugins/TurboReg から - turboRegDialog.class - turboRegFinalAction.class - turboRegImage.class - tuboRegMask.class - turboRegPointHandler.class - turboRegProgressBar.class - turboRegTransform.class
------------------------

 これでTurboReg on Matlabが完成。
すごく便利す。
使用用途に合わせてMotionCorrection_TurboReg.mをいじって使わせて頂いています。

 少々間違えているかもですが、３つのサイトの中のどこかから辿れます。
便利なインストール用シェルスクリプトとかを書くつもりはありません。
悪しからず。

 で、さらに便利そうなのはここでつかっているMIJというもの。どうやらTurboRegを作ったラボと同じラボでつくったMatlabとImageJのインターフェース。
これ自体はイントールは難しくない。Matlab本体のappのディレクトリ下のjava/jarフォルダ内にij.jarとmij.jarを入れるだけ。
使い方は大元サイトにあります。（これもあまり丁寧ではないけど）
投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル: ,

2012年3月13日火曜日

逆行性トレーサープロトコル（Cholera Toxin Subunit B: CTB）

トレーサー実験のプロトコル。今回は逆行性トレーサーとしてCholera Toxin Subunit Bを使った。 濃度注意。まず、同じ実験をしている論文を読んで参考にする。製品に付いている説明書?の濃度で溶かしてしまうと取り返しが付かないことに…。次回以降注意。
プロトコル
自作

Nature Protocolより
Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats.
投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:

PCR

実験

PCR

試薬

Genotyping Reagent
  • D.W.
  • 10×ExBuffer
  • プライマー
  • ポリメラーゼ（Ex taq）
  • DNA
  • 各量はPCRを行いたい個所の配列により異なる（全て数ul）

手順
  1. DNAの汚染を防ぐためフィルター付きピペットチップを使う。また、作業が煩雑になるのでどこまで進んだかわかるように工夫を重ねる
  2. 容器にGenotyping Reagentを分けて、DNAを入れる
  3. PCRにかける（分離95℃→結合60℃→増幅72℃を繰り返す。時間は配列の長さによって決まる）

投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:

DNA抽出

実験

DNA抽出（マウスの尾から）

試薬

1M Tris-HCl (pH8.0, 100ml) 1M Tris-HCl (pH7.5, 100ml)
  • Tris 12.11g
  • HCl 4.2ml (pH8), 6.5ml (pH7.5)
  • milliQ 100mlくらい
  • TrisをmilliQ（約80ml）に溶かす
  • HCｌをpHが既定の値に達するまで加える
  • milliQを100mlまで加えてメスアップ
  • オートクレーブ

0.5M EDTA (100ml)
  • Na2EDTA.2H2O 18.61g
  • NaOH pellet 約2g
  • milliQ 100ml (だいたい)
  • pHが8になるまでNaOH　pelletを加える（EDTAはｐH8以下では溶けない）
  • milliQでメスアップ

10% SDS (sodium dodecyl sulfate, 100ml)
  • electrophoresis grade SDS 10g
  • milliQ 100ml (less)
  • milliQ90mlにSDSを加える
  • 容器を65度のウォータプールに入れる
  • 溶けたらmilliQでメスアップ
  • オートクレーブは駄目

TE (50ml, ファルコンチューブ)
  • 1M Tris-HCl(pH8.0) 500μl
  • 0.5M EDTA 10μl
  • D.W.でメスアップ

TBS 50ml
  • 50mM Tris-Cl （pH7.4-8.0） 2.5ml
  • 100mM NaCl 1ml
  • 5mM EDTA 0.5ml

Lysis buffer（11.2ml+α）
  • TBS 11.2ml
  • 10%SDS 560ul
  • ProteinaseK 112ul

手順
  1. マウスの尾を5mm～1cmカットし、個体ごとにチューブに入れる
  2. 各チューブにLysis　Bufferを400ulずつ入れる
  3. 55度インキュベータでオーバーナイトで溶かす
  4. （クロロホルム処理）
  5. 各チューブに100％エタノールを500ulずつ入れる（少し混ぜる）
  6. 遠心する（15000rpm、10分）
  7. エタノールを取り除き、70％エタノールを入れて洗う
  8. 遠心（15000rpm、5分）
  9. エタノールをできる限り取り除く
  10. フラッシュ遠心
  11. エタノールを完全に取り除き、TEを100ul入れる
  12. 37度インキュベータでDNAをTEに溶かす

投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:

切片作成（25um, コロナル）

実験

切片作成（25um,コロナル）

試薬

PBS　500ml
  • 10×PBS 50ml
  • milliQ 450ml

O.C.T. Compound

手順
  1. PBS→15％スクロース→30％スクロース→OCTの順に置換。－80℃で保存
  2. クライオスタッドで切断
  3. 脳をクライオスタッドの中に入れておき切りやすくする
  4. クライオスタッドの台座にOCTを塗り、脳を乗せて脳を台座に固定する
  5. 脳を切断場に固定し調整した後、切片を作成していく
  6. 切断した切片はPBSに入れる

投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:

Nissl染色

実験

Nissl染色

試薬

PBS　500ml
  • 10×PBS 50ml
  • milliQ 450ml

70％エタノール（200ml×2）
  • D.W. 120ml
  • 100％エタノール　280ml

85％エタノール（200ml×1）
  • D.W. 30ml
  • 100％エタノール　170ml

95％エタノール（200ml×1）
  • D.W. 10ml
  • 100％エタノール　190ml

100％エタノール（200ml×3）

Gresyl Violet（200ml×1）

キシレン（200ml×3）

オーキット

手順
  1. 1分：PBSで洗う
  2. 2分：70％エタノールで脱脂
  3. 10分：Cresyl Violetで染色
  4. 1.5分：70％エタノールで脱水
  5. 1分：85％エタノールで脱脂
  6. 1分：95％エタノールで脱脂
  7. 1分：100％エタノールで脱脂
  8. 1分：100％エタノールで脱脂
  9. 1分：100％エタノールで脱脂
  10. 1分：キシレンで透徹
  11. 1分：キシレンで透徹
  12. 1分：キシレンで透徹
  13. オーキットで包埋する

投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:

切片作成（100μm,サジタル）

実験

切片作成（100μm,サジタル）

試薬

PBS　500ml
  • 10×PBS 50ml
  • milliQ 450ml

PBST 500ml
  • PBS 500ml
  • Triton X-100 500μl (0.1%)

手順
  1. ブレインマトリックスなどを用いて脳を固定し、両刃剃刀正中面を切断
  2. マイクロスライサーで脳を切断していく（しっかりと固定する）
  3. スピードは遅め、振動数は多めのほうがきれいに切れる
  4. 切断した切片はPBSに入れておく
  5. 切片をスライドに乗せる
  6. シャーレにPBSTを満たす
  7. 鉛筆やシャーペンなどでスライドに必要事項を書く
  8. 筆をうまく使ってスライドガラスに切片を乗せる
  9. しばらく乾かす
  10. （染色を行わない場合）Immu-Mountとカバーガラスで包埋
  11. （薄く切らなかった脳を保存する場合）スクロースに置換。PFA→15％スクロース→30％スクロース

投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:

灌流固定

実験

灌流固定

試薬

4％PFA 400ml
  • PFA　17.58g
  • 10N NaOH 15.2μl
  • milliQ 160ml
  • 1M PB40ml
  • 試験瓶に直接作る。PFA,NaOH,milliQを入れ55℃で温める。溶けたら、冷まして１MPBを加え、milliQで400ｍｌにする

150mM NaCl 50ml
  • 5M NaCl 1.5ml
  • milliQで50mlにする

PBS 500ml
  • 10×PBS 50ml
  • milliQ 450ml

5M NaCl 100ml
  • NaCl 29.2g
  • milliQ 80ml以上
  • 80mlでは溶けないので（milli）Qを加えながら溶かす。溶けたらQで100mlにメスアップ。オートクレーブ

2.5% アバチン 10ml
  • 100％アバチン 250μl
  • PBSで10mlに。遮光して4℃で保存

1M PB 500ml
  • Na2HPO4・12H2O 138.6g
  • NaH2PO4・2H2O 17.6g
  • レンジで温めたQに溶かしたあと、500mlにQでメスアップ。オートクレーブ

手順
  1. アバチン（0.5ml）をマウスに腹腔内注射し麻酔する
  2. 体重測定。尾を切断（30℃で保存）
  3. マウスを手術台に固定。開腹開胸し、心臓を露出させる
  4. ぺリスたポンプで灌流固定。遅い速度で150mM NaClを流しながら先を少し曲げた注射針を左心室に入れ、右心耳を切る
  5. 150mM NaClを250ml/minで￥の速度で2分間灌流。肝臓から血が抜けるのを確認
  6. 灌流液をPFA（氷冷、40ml）に変え、250ml/minで液がなくなるまで灌流。尾が踊るのを確認
  7. マウスの脳を取り出して、PBS（氷冷）の中に入れておく

投稿者 時刻: 0 件のコメント:
ラベル:
登録: 投稿 (Atom)